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Cette page va vous expliquer le principe en détail du Western blot: concentration de la bande de protéines dans le gel de concentration (stacking gel) appelée aussi isotachophorèse, et du principe de la séparation (électrophorèse de zone monophasique). La partie révélation (ou détection) n'est pas détaillée dans la mesure où il en existe un certain nombre (colorimétrie, chimiluminescence, autoradiographie, fluorescence) et que l'on trouve le détail de ces techniques assez facilement et de manière détaillée.

Mise à jour : en fonction des sources vous verrez ou entendrez que le western blot se déroule en 3 étapes (électrophorèse, transfert et révélation) comme la définition du Larousse. Pour d'autres sources le Western blot n'est que l'étape de tansfert des protéines, comme par exemple sur Wikipedia.
Alors ? qui croire ? comme son nom l'indique, blot signifie buvardage en anglais, donc le Western blot est l'étape de transfert. Mais dans la plupart des cas, quand on parle de Western blot on fait référence à l'ensemble des étapes (électrophorèse, transfert et révélation).

I. Les gels électrophorétiques

Pour pouvoir identifier les protéines selon leurs poids moléculaires, on peut utiliser l'électrophorèse. L'électrophorèse est la migration de particules chargées placées sous l'influence d'un champ électrique, ceci se faisant au travers d'un gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécylsulfate (SDS). On parle alors de SDS-PAGE : SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.

1.1. Formation du gel de polyacrylamide

Le réseau de polyacrylamide est formé par polymérisation de monomère d'acrylamide (ou acryl) en présence de petite quantité de bis acrylamide (nn'méthylène-bisacrylamide). Le bis acrylamide, appelé aussi bis, est l'équivalent de 2 monomères d'acrylamide liés par un groupement méthyl et est utilisé comme agent pontant.

figure monomère SDS PAGE
Figure 1 : Formules des monomères

On peut définir le pourcentage C de bis par rapport au poids total d'acrylamide utilisé : C=100*poids (bis)/ poids(acrylamide+bis). Un gel à faible pourcentage de C (de 2 à 4%) est un gel homogène, la densité moyenne des chaînes de la matrice est constante dans toutes les directions de l'espace. Les éléments topologiques les plus abondants sont des singletons (chaînes reliées par leurs 2 extrémités à 2 ponts différents, voir figure 4 en bleu).

L'acrylamide se polymérise en longue chaîne et, de temps en temps, une molécule de bis acrylamide est incorporée dans le polymère. La polymérisation de l'acrylamide est un exemple de catalyse par radicaux libres initiée par l'addition de persulfate d'ammonium et de TEMED (NNN'N'-tétraméthyléthylènediamine). Le TEMED catalyse la décomposition des ions persulfates pour donner un radical libre R• (molécule avec un électron seul) :

initiation de la polymerisation TEMED
Figure 2 : Initiation de la polymérisation

Si on représente ce radical R• et M un monomère d'acrylamide, on peut alors représenter la polymérisation ainsi :

réaction polymérisation SDS page polyacrylamide
Figure 3 : Réaction de polymérisation

La polymérisation continue jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de monomère d'acrylamide (M) libre. Cette polymérisation incorpore des molécules de bis acrylamide comme si c'étaient des molécules d'acrylamide, ceci ne change rien à la réaction de polymérisation en elle-même, mais permet de lier deux polymères d'acrylamide entre eux.

structure moléculaire gel SDS PAGE
Figure 4 : Structure moléculaire du gel

1.2. Caractéristiques générales du gel

Le système utilisé pour le Western blot comprend deux modes successifs de migration électrophorétique, une isotachophorèse (gel de concentration), puis une électrophorèse de zone monophasique (gel de séparation). le passage de l'une à l'autre se fait avec un changement de ph et par une augmentation de concentration en acrylamide du gel.

L'objectif du gel d'électrophorèse en deux parties est de pallier aux problèmes liés aux faibles quantités de protéines et aux volumes parfois non négligeables déposés dans les puits. on réalise donc une étape de concentration des échantillons jusqu'à l'obtention de zones protéiques très fines dans le gel de concentration (stacking gel), qui migreront dans le gel de séparation (resolving gel).

1.3. Caractéristiques moléculaires

Le taux de réticulation, qui correspond à la porosité du gel, dépend du poids d'acrylamide et de bis contenu dans 100 ml. Le gel de concentration est de 4%, et le gel de séparation entre 7 et 15 % suivant la taille des protéines que l'on veut séparer. pour une bonne séparation de la protéine étudiée (a, voir figure 9) par rapport aux autres protéines, nous utiliserons un gel à 10%. Les conditions d'incubation des protéines avec le dodécyl sulfate de sodium (sds) sont habituellement telles que chaque espèce protéique adsorbe environ 1.4g de SDS par gramme de protéine, soit une molécule de SDS pour 2 acides aminés, l'adsorption se fait grâce à la chaîne aliphatique du SDS. La présence de ce détergent anionique hautement chargé dénature la chaîne protéique, qui se déroule alors en pelote statistique et masque complètement ses charges naturelles en la recouvrant uniformément. La charge électrique propre à chaque molécule devient alors négligeable. C'est ainsi que chaque protéine acquiert une densité de charge identique. Le fait que le SDS rende négatives les protéines permet de les séparer en fonction de leurs tailles (donc de la masse molaire) et non pas en fonction de leurs charges. Les protéines présentent une migration électrophorétique inversement proportionnelle au logarithme de leur masse moléculaire.

mobilité proteine dans gel SDS page electrophorese
Figure 5 : Mobilité de différentes protéines en fonction du logarithme de leur poids moléculaire

Le RF représente le rapport de la distance parcourue par la protéine sur la distance parcourue par le front de migration.

Le tampon de l'échantillon versé dans chaque puits contient un colorant ionisé, généralement le bleu de bromophénol qui permet de suivre l'électrophorèse. Ce tampon contient aussi du sucrose ou du glycérol, lesquels donnent une densité à l'échantillon permettant ainsi à l'échantillon d'être déposé facilement au fond des puits.

depot echantillon gel SDS PAGE elecrtophorese
Figure 6 : Dépôt d'échantillon d'électrophorèse

II. Phénomènes impliqués lors d'une électrophorèse.

Lorsqu'une solution contenant différents électrolytes est soumise à l'action d'un champ électrique, on assiste dans un premier temps à un phénomène de déplacement des molécules ionisées vers leur électrode respective. Les anions, chargés négativement, se dirigent vers l'électrode positive, l'anode, alors que les cations, chargés positivement, se dirigent vers l'électrode négative, la cathode. La force électrique qui s'exerce sur chaque espèce moléculaire dépend de la valeur de leur charge effective qui, pour un électrolyte faible ou un amphotère, dépend du ph du milieu.

2.1. Notion d'unité électrophorétique de base

Si on représente 2 phases électrolytiques contenant des ions A (arrière-garde) et des ions B (pilotes), tous deux chargés négativement, ils migreront sous l'effet du champ électrique vers l'anode. A et B étant au départ séparés, on appelle la limite (frontière artificielle) les séparant la limite AB (figure 7.1). dans la phase A, il n'y a pas de constituant B et dans la phase B il n'y a pas de constituant A. Soit Va la vitesse de migration de A et Vb la vitesse de migration de B.

mobilite d'un ion electrophorese
Figure 7 : Mobilité relative d'un ion

Si Va > Vb (figure 7.2): les ions A moins mobiles, sont devant, ils vont sans cesse rattraper les ions B et les dépasser. La frontière AB va disparaître.

Si Va < Vb (figures 7.3 et 7.4): les ions A, moins mobiles, sont derrière, ils ne peuvent donc pas rattraper les ions B qui sont plus mobiles.

Il n'est pas possible qu'un vide d'ions puisse se créer (dessin 7.3), qui se traduirait par une rupture de courant électrique que l'on ne constate pas. En fait la seule possibilité est que la frontière AB se déplace tout en continuant à séparer les 2 phases. Les deux espèces ioniques A et B migrent donc à la même vitesse.

Pour avoir va = vb, il faut donc une régulation concomitante du champ électrique et de la concentration des ions dans les différentes phases électrophorétiques. Le champ électrique varie en fonction de la vitesse de l'ion : pour les ions d'arrière garde (lents), le champ électrique sera plus important, ce qui va augmenter leur vitesse. Pour les ions pilotes (rapides), le champ électrique sera moins important, ce qui va diminuer leur vitesse.

Le champ électrique sera plus élevé et la concentration des ions plus faible dans la phase la moins mobile. Ceci permet d'expliquer pourquoi la limite ab ne disparaît pas mais aussi pourquoi la limite est précise. Si des ions B devaient trop ralentir, ils se retrouveraient avec les ions A où le champ électrique est plus fort donc ils seraient accélérés (exclus de A) et rejoindraient les autres ions B. Réciproquement pour des ions A qui iraient un peu trop vite, ils seraient retardés à cause du champ électrique qui est plus faible pour les ions B.

2.2. Isotachophorèse, principe de la concentration

Le gel de concentration a pour but de concentrer le dépôt fait dans le puit en une fine bande de protéines, ce qui permet de mettre un volume relativement grand sans perte de résolution. L'isotachophorèse utilise le fait que le complexe protéines-sds ait une mobilité électrophorétique intermédiaire entre les ions glycinates (du tampon du réservoir) et les ions chlorures (dans le gel). Les ions glycinates sont donc les ions d'arrière gardes (faible mobilité à cause du ph qui est de 6.8) et les ions chlorures, les ions pilotes. Ceci induit la formation de 2 limites mobiles : une entre l'ion d'arrière garde et le complexe sds-protéines et une entre SDS-protéines et l'ion pilote. Il y aura ensuite formation d'autres limites mobiles séparant les différentes protéines classées selon leurs mobilités. Les plus lentes seront côté ion d'arrière garde et les plus rapides côté ion pilote. Une fois les composés ioniques " rangés " selon leur ordre de mobilité (on parle alors de pile ou d'empilement) la concentration molaire des protéines devient du même ordre de grandeur que celle établie pour les tampons pilotes et d'arrière garde. Ce qui correspond à une concentration massique de protéines de l'ordre de 10 à 100 mg/ml. Comme la quantité de complexe protéines-SDS est faible, il va se concentrer en une bande très fine entre les ions chlorures et les ions glycinates.

Une fois cette pile est formée, elle continuera à migrer jusqu'au gel de séparation où l'on aura un changement de caractéristiques du milieu donc de migration des différents ions.

Le changement de caractéristiques pendant le passage dans le gel de séparation se fait à deux niveaux :

  • Le gel devient plus réticulé, la porosité est diminuée et donc sert de tamis moléculaire, sans pour autant freiner les ions de petites tailles du tampon d'arrière garde.
  • le gel de séparation a un ph différent, il est basique (ph=8.8, le gel de concentration étant à 6.8) ceci ne fait pas varier la mobilité des protéines mais augmente la mobilité des ions glycinate d'arrière garde qui sont complètement ionisés à ce pH.
vitesse ions dans un gel electroporetique
Figure 8 : vitesse des différents composés ioniques

Les vitesses de migration indiquées dans le tableau de la figure 8 sont celles des différents acteurs de l'électrophorèse, ce sont en fait les vitesses au niveau de la bande de protéines si ces ions étaient seuls. Pour T1, la vitesse des ions glycinates est faible car le pH est de 6.8, proche du pHi des ions glycinates (ces ions seront donc faiblement chargés) alors que les protéines et les ions chlorures migrent rapidement. Comme il est expliqué dans la figure 7 (mobilité relative d'un ion), on ne peut avoir séparation des différents ions, donc les ions glycinates, les protéines et les ions chlorures vont migrer à la même vitesse.

2.3. Electrophorèse de zone monophasique, principe de la séparation

La concentration en acrylamide du gel de séparation est fonction du poids moléculaire des molécules à séparer.

Poids moléculaire (kda)Pourcentage d'acrylamide
10 - 4015 - 20>
40 - 10010 - 15
100 - 3005 - 10
300 - 5005
> 5002 - 5

Comme nous utiliserons un gel à 10 %, toutes les protéines dont le poids moléculaire se situe entre 30 et 80 kDa seront biens séparées les unes des autres. La vitesse de migration des complexes protéines-SDS sera diminuée, car ils devront traverser les pores du gel. La vitesse de migration des ions glycinates sera augmentée dans le gel de séparation, car le pH du gel de séparation est de 8.8, et à ce pH les ions glycinates ont une pleine charge négative. Etant constamment dépassées par les ions d'arrière gardes, les protéines migrent donc dans les conditions des électrophorèses de zones pour lesquelles les protéines sont moins rapides que les ions porteurs. Dès lors que les protéines se font dépasser par les ions glycinates, la mobilité électrophorétique des ions chlorures n'a plus d'intérêt dans le principe de la séparation des protéines.

Comme les complexes protéines-SDS ont la même charge par unité de longueur (une molécule de sds pour 2 acides aminés), ils traversent le gel de séparation sous le champ électrique avec la même mobilité. Cependant, comme ils passent au travers d'un gel de séparation, avec des pores relativement petits, les différents complexes protéines-SDS se séparent grâce aux propriétés du tamis moléculaire du gel. Les petites protéines vont vite car elles passent facilement dans les pores du gel, mais les grosses protéines sont retardées par friction avec le polymère. Le bleu de bromophénol, contenu dans le tampon de l'échantillon, n'est absolument pas retardé et indique donc le front de migration électrophorétique. Quand le colorant atteint le bas du gel, l'électrophorèse est arrêtée.


Vos questions, vos commentaires :
cooky - Le 2010-11-22 20:30:11
J'ai vu faire des western blot en 3 étapes : 2 électrophorèses suivis d'1 Elisa.
Je ne vois pas ces étapes dans votre description.
Connaissez-vous ces méthodes ?

Merci (sinon c'est très clair)
Profbioch - Le 2010-11-23 08:54:32
Bonjour, il existe un certain nombre de variante, j'image que les 2 gels de séparations avaient des propriétés différentes, aussi bien au niveau du pH que du niveau de réticulation du gel.
ramyroux - Le 2010-11-24 16:19:42
bonjour
jaimerai bien connaitre le principe de l'electrophorese sur urea page et c'est limitation svp
merci pour votre reponse
ThanhAgro - Le 2011-02-09 14:43:09
Merci monsieur ProfBioch. C'est très intéressant. Permettez-moi de traduire en vietnamien pour que les étudiants vietnamiens puissent le lire facilement.
miles - Le 2011-02-09 15:17:14
Bonjour,

Je vous remercie pour ces explications concises mais très claires sur l'électrophorèse.

J'avais comme notion que le rapport de concentration des ions entre deux parties voisines de la colonne de migration (entre deux «piles») à l'équilibre dépendait d'une relation impliquant la mobilité de chacun des ions ainsi que leur charge (fonction régulatrice de Kohlrausch). La question que je demandais était la suivante : La valeur absolue à l'équilibre de la concentration dans chaque pile dépend de quoi? Dépend-elle de la force du champ électrique? Ou plutôt de la concentration initiale de chaque ion dans le milieu (les ions se disperseraient alors selon la relation Kohlrausch de sorte à ce que le circuit électrique ne soit jamais brisé)? Ou d'un autre facteur dont je ne tiens pas compte?

Merci
Profbioch - Le 2011-02-09 15:17:59
Bonjour ThanhAgro, je vous autorise à traduire en vietnamien cette page, à condition de mettre un lien vers la page originale. N'hésitez pas à revenir mettre votre URL une fois que le travail sera fait.
Profbioch - Le 2011-02-09 15:32:58
Bonjour miles, vous parlez de quel équilibre de concentration ? concentration molaire ? si c'est le cas alors je vous renvoi sur la figure 7 où on voit A et B se placer sous l'effet du champ électrique vers l'anode. B va plus vite que A mais comme il ne peut pas y a avoir de "trou" électrique B est ralenti et A accéléré.
StudentBe - Le 2011-03-03 11:51:27
Bonjour,
je réalise un travail de documentation sur le sujet, auriez-vous des références qui me permettent authentifier vos explications, qui sont d'ailleurs très claires et complètent.

Merci déjà
Profbioch - Le 2011-03-03 14:13:03
Bonjour, les informations proviennent non pas d'un livre de biochimie mais d'un livre de physique (très orienté électricité) si mes souvenirs sont bons, je vais essayer de retrouver les réf ce week end, je vous tiens au courant.
StudentBe - Le 2011-03-03 15:51:07
C'est fort aimable de votre part.
samgamegie - Le 2011-03-08 16:32:30
Bonjour,
Ce cours est très intéressant, notamment pour réviser les concours ITRF.
Par contre, une question :
Dans le II : phénomènes impliqués lors de l'électrophorèse : "les anions, chargés négativement, se dirigent vers l'électrode positive, l'anode, ". L'électrode positive ne serait-elle pas plutôt la cathode ?
abou - Le 2011-04-08 15:24:51
Bonjour,
S.V.P j'aimerai savoir ce qui pourrait empêcher la migration sur un gel de polyacrylamide. merci d'avance
samgamegie - Le 2011-04-15 14:07:02
non samgamegie, l'électrode négative attirant les cations est bien la cathode et l'électrode positive attirant les anions (-) s'appelle l'anode
etudiante immuno - Le 2011-05-09 11:32:25
bonjour,
mon question est: est ce que l'ordre du mélange des produits pour faire un western est important? c a dire il y a du preference pour mettre l'acrylamide et l'APS a la fin et les tampons 6.8 ou 8.8 et le SDS au debut de la ^preparation ou ca n'a aucune importance?
merci
Green - Le 2011-05-13 15:22:55
C'est tout ? c'est ce que vous appelez le western blot. Le wester blot est, comme vous l'avez si bien indiqué électrophorèse, transfert et révélation. Meme si les étapes de révélation sont effectivement multiples, l'étape de transfert n'est pas à oublier. C'est quand même cette étape qui est la clef de cette méthode. Le reste n'est qu'une électrophorèse et un test ELISA. C'est dommage de résumer cette technique à l&#8217;électrophorèse uniquement
gnirako - Le 2011-06-13 21:46:29
COMMENT CALCULER LE POIDS MOLECULAIRE DANS L'ELECTROPHORESE BIDIMENSIONNELLE? J'AIMERAI AVOIR PLUSIEURS EXERCICES CORRIGES SUR LE CALCUL DU POIDS MOLECULAIRE
gnirako - Le 2011-06-13 21:47:56
COMMENT CALCULER LE POIDS MOLECULAIRE DANS L'ELECTROPHORESE BIDIMENSIONNELLE? J'AIMERAI AVOIR PLUSIEURS EXERCICES CORRIGES SUR LE CALCUL DU POIDS MOLECULAIRE
joe - Le 2011-07-18 18:38:26
avant de remplir les puits du gel pour la migration des proteines;surtout quand on a à comparer entre eux des valeurs,pour cela il faut diluer les valeurs quantitatives recues par spectrophotometre. ma question est que la dilution se fait par l'eau distillée ou par le PBS?
flower - Le 2011-11-10 18:58:43
J'ai une grande confusion car je ne sais^pas la vraie différence qui existe entre electrophorèse, éléctrofocalisation et SDS!!! c koi le lien entre ces trois svp? et comment savoir si on doit suivre la technique d'élctrophorèse plûtot que l électrofocalisation pour caractériser une protéine? merci de me répondre
kaiso - Le 2011-12-04 13:31:00
merci pour l'explication mais j'ai du mal a comprendre le jeu entre les déférentes ions
sarrou - Le 2012-03-01 13:23:27
je demande un protocole de transfert smi sec svp et merci
sarrou - Le 2012-03-01 13:25:31
j'ai eu du mal pour transferer mes proteines de haut poid moléculaire je veux juste savoir si le transfert semi sec me donnera un resultat plus net?? merci
SAP - Le 2012-05-16 18:15:30
Bonjour :)
J'aurais juste une question, est-ce que quelqu'un pourrait m'expliquer le mécanisme de réticulation du polyacrylamide ? j'ai essayé de le faire mais je trouve un cycle à trois atomes (N,N,C), ce qui est moyennement favorisé, mais je ne vois pas d'autres manières de l'écrire :/
Merci d'avance :)
CC - Le 2012-08-14 10:09:10
@SAP :
une chaîne de polyacrylamide non réticulée :
-CH2-CH(CONH2)-CH2-CH(CONH2)-CH2-CH(CONH2)- ...

une chaîne réticulée : il faut intercaller un motif MBA (ou méthylène bis-acrylamide) et faire réagir sa seconde fonction polymérisable, il n'y a pas formation de cycle, mais plutôt d'un réseau :

CH2-CH(CONH2)-CH2-CH-CH2-CH(CONH2)-CH2-CH(CONH2)-
|
C=O
|
NH
|
CH2-CH(CONH2)-CH2-CH-CH2-CH(CONH2)-CH2-CH(CONH2)-
CC - Le 2012-08-14 10:11:16
désolée, la mise en forme a tout décalé, avec des '.' ce sera surement plus clair :
CH2-CH(CONH2)-CH2-CH-CH2-CH(CONH2)-CH2-CH(CONH2)-
..................|
..................C=O
..................|
..................NH
..................|
CH2-CH(CONH2)-CH2-CH-CH2-CH(CONH2)-CH2-CH(CONH2)-
CC - Le 2012-08-14 11:00:34
Pff, pas beaucoup mieux : le groupement est bien sur à attacher au -CH- (sur la chaîne du haut comme sur celle du bas).
hulk1906 - Le 2013-01-23 21:06:26
Bonjour,
J'ai une question qui peut paraître idiote quant à l'incubation de la membrane avec l'anticorps primaire. Je souhaiterais savoir si, lorsque les lysats cellulaires proviennent de cellules humaines, on peut utiliser des Anticorps primaires provenant d'espèces différentes ( ex: souris, lapin) pour détecter les protéines spécifiques humaines (ex: caspase...) . Merci d'avance.
sofianBio - Le 2013-02-21 09:52:39
[bonjour, je vous remercie monsieur pour ce résumé qui m'a bcp aider dans ma recherche a propos de la technique de western blot......... mais vu que c'est un travail de documentation je vous demande monsieur la même chose que StudentBe. et c'est très gentil de votre part d'accepté ma demande.]
ahap - Le 2013-06-29 10:34:47
bonjour tout le monde
je suis une étudiante deusieme année master mon stage de fin d'étude est l'electrophorese, s'il vous ,pouvez vous m'aider par l'envoi d'un exemple de rapprt de stage consernant mon sujet,mon e-mail c'est: salimammt@gmail.com
merci d'avance
souma dada - Le 2013-12-24 11:25:06
salut, comment faire électrophorèse



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