La replicationchez les eucaryotes, procaryotes, différences et transcription inverse (reverse transcriptase)

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INTRODUCTION

Structure I des acides nucléiques

Propriétés physicochimiques hybridation

Acides nucléiques et information génétique

BIOSYNTHESE DE L'ADN

La réplication chez les eucaryotes

La réplication chez les procaryotes

Différence entre procaryotes et eucaryotes

BIOSYNTHESE DE L'ARN

Transcription chez les eucaryotes

Transcription chez les procaryotes

ARN replicase ou ARN synthétase

BIOSYNTHESE DES PROTEINES

Traduction chez les eucaryotes

Traduction chez les procaryotes

GRENIER

Formules des acides nucléiques

Actualités dans le monde de la biochimie

Replication chez les eucaryotes

Par rapport aux procaryotes la réplication est plus rare, car l'initiation est très contrôlée, de plus, l'ADN est sous forme de chromatine. L'ADN s'enroule autour d'un octamère d'histones (200pb autour de (h₂a h₂ b h₃ h₄)₂ ) formant ainsi un nucléosome.

Les ADN polymérases

Il en existe 5 : alpha béta gamma delta epsilon. Alpha delta et epsilon participent à la réplication du chromosome.

ADN polymérase	Nombre de sous unités	Activités
Alpha	4	1 polymérase 2 primases 1 pour le maintient de la structure alpha n'a pas d'activité exonucléasique 3'->5'
Delta	2	1 activité exonucléasique 3'->5' pas d'activité primase, processivité faible
Epsilon	2	1 activité exonucléasique 3'->5' Pas d'activité primase, forte processivité
Béta	1>	impliquée dans la réparation de courts fragments d'ADN
Gamma	1	1 activité exonucléasique 3'->5' responsable de la réplication de l'ADN mitochondriale dont la réplication est indépendante de l'ADN nucléaire

Initiation

Compte tenu de la taille des brins d'ADN chromosomique la réplication a certainement plusieurs origines de réplication.

Chaques origines de réplication est appelée oeil de réplication.

oeil de réplication dans l ADN chromosomique, origine de replication

Pour un oeil de réplication, on a 2 complexes multienzymatiques qui vont en sens inverse. Chez les eucaryotes les fragments d'Okazaki sont plus petit (environ 200pb). Ces fragments ont à leur extrémité 5' des fragments d'arn (10 nucléotides) syntéthisés par une primase:

Soit alpha synthétise les amorces ARN et les allonge sur le brin à synthèse discontinue de l'ADN naissant. Pour le brin à synthèse continue le complexe ADN polymérase delta/pcna synthétise le brin d'ADN(pcna est une protéine qui augmente fortement la processivité).
Soit alpha est uniquement responsable de la synthèse des amorces et quelques désoxynucléotides. Le brin continu est répliqué par epsilon; delta/pcna réplique le brin discontinu.

Dans tous les cas on a sur un brin une ADN polymérase très processive et sur l'autre brin la processivité est moindre.

Lors de la réplication l'adn simple brin est stabilisé grâce à des protéines : rp-a ou rf-a, équivalent aux ssb chez E.Coli (single stranded dna binding protein). Les amorces arn sont supprimées par la rnase h, les trous ainsi formés sont bouchés par béta ou alpha. Les fragments sont reliés une adn ligase. il existe 3 adn ligase (i, ii,iii) dont la i est indispensable à la réplication du chromosome. Quand aux topo-isomérases, il y en a 2 (i et ii).

Terminaison

D'après des études sur SV40 (réplication bidirectionnelle) la réplication s'arrête sous l'effet de contraintes topologiques.

Activite correctrice des ADN polymerases :

Procaryotes : pour E.Coli (4.10⁶pb) le taux d'erreurs acceptable serait de l'ordre de 10^-6 à 10^-7 mais la seule complémentarité des bases ne le permet pas. Ceci étant dû à la tautomérisation. Si on a ajout d'un nucléotide sous la forme énol, le retour à la forme céto provoque un mésappariement. L'ADN polymérase est alors bloquée et doit revenir en arrière grâce à son activité exonucléasique 3'->5' ( sous unité epsilon de l'adn polymérase iii).
Eucaryotes : le génome est beaucoup plus important (homme 3.5 10⁹pb) la fidélité doit être de 10⁹. Ceci est peut être dû à une activité exonucléasique 3'->5' sur delta et alpha. Plus les polymérases sont processives, plus le taux d'erreurs est faible.

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Replication chez les procaryotes

L'enzyme réplicatif n'est pas l'ADN pol I mais III. L'ADN pol II serait impliquée dans la réparation de l'ADN.

Initiation

E.Coli n'a qu'une origine de réplication. L'initiation se passe en 3 étapes :

Reconnaissance de la séquence d'origine par une seule protéine.
Ouverture dans une région riche en A et T, proche ou dans l'origine de réplication.
Assemblage du complexe de réplication dans la partie ouverte de l'ADN.

L'ouverture de l'ADN se fait grâce à la DNA a, ensuite la DNA b (hélicase) sépare les 2 brins sur une plus grande distance dans le sens 5'->3'. Pri A agit de la même façon de 3'->5'.

L'ouverture de l'ADN va provoquer des supertours qui vont être éliminés par l'ADN gyrase (topo-isomérase). Une fois que l'ADN est dans de bonnes conditions topologiques, l'amorce est synthétisée par la primase. Ce complexe protéinique est le complexe d'initiation ou primosome.

Progression de la fourche de replication

Chez E.Coli la principale enzyme est l'ADN polymérase III holoenzyme. C'est une enzyme réplicative sous la forme d'un dimère asymétrique constituée de 10 polypeptides (en fait 2*5).

3 pour le noyau (core) de l'enzyme:
- alpha : polymérase
- epsilon exonucléase 3'->5'
- psi : activité inconnue
2 béta se fixent au core de façon à lier fortement le core à l'amorce et au modèle.

La partie très processive s'occupe certainement de la synthèse continue pendant que la partie moins processive s'occupe de la synthèse discontinue.

L'ADN est déroulé par une ADN hélicase (1) ou DNA B, les supertours ainsi produits sont éliminés par une topo-isomérase (2) ou ADN gyrase. Les simples brins d'ADN formés sont stabilisés par des protéines SSB (3) (single stranded dna binding protein), elles permettent aussi d'éviter la dégradation de l'ADN par les dnases. La primase (5) synthétise les amorces ARN (en bleu) des fragments d'Okazaki. La primase est différente de l'ARN pol : elle est résistante à la rifampicine, synthétise des courts fragments (10 nucléotides) et n'est pas spécifique de la séquence d'initiation.

Ces amorces sont ensuites prolongées par l'ADN pol III holoenzyme. L'ADN pol I prend le relais jusqu'au fragment d'Okazaki suivant, elle dégrade l'amorce ARN du brin grâce à son activité exonucléasique 5'->3' non spécifique de l'ADN tout en remplaçant le brin d'ARN par de l'ADN. Une fois que l'amorce ARN a été entièrement remplacée par de l'ADN les 2 fragments sont reliés covalemment par l'ADN ligase qui forme une liaison phosphodiester entre un 3' oh et un 5' monophosphate. L'ADN ligase est inactive sur une extremité 5' monophosphate ARN.

Tout ces enzymes sont ensemble de manière à former un complexe dont la vitesse peut atteindre 500 à 1000 nucléotides par seconde. Ce complexe s'appelle le replisome et il peut se charger de la synthèse des 2 brins (précoce et tardif) à condition qu'il y ait une boucle formée par le brin d'adn tardif. La synthèse se fait sur les 2 brins simultanément car ils ont la même polarité.

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La transcription inverse

La transcription est la réaction de synthèse d'ARN avec comme matrice un brin d'ADN; cette réaction est catalysée par l'ARN polymérase ADN dépendante (ou transcriptase). La transcription inverse est la réaction inverse de la transcription. C'est la synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice ARN grâce à l'ADN polymérase ARN dépendante ou encore transcription inverse ou reverse transcriptase.

In vivo : comme pour la transcription, une amorce est nécessaire. L'ADN qui est synthétisé sert en même temps de matrice pour la synthèse d'un autre brin d'ADN : transciption inverse, reverse trancriptase

transciption inverse, reverse trancriptase

L'ADN bicaténaire peut être intégré dans l'ADN de la cellulle hôte, on parle alors de provirus ou de prophage. Le traitement du SIDA se fait grâce à un inhibiteur de la reverse transcriptase : l'AZT (azidothymidine).

In vitro : on peut volontairement synthétiser un brin d'ADN à partir d'un ARN en particulier de l'ARNm eucaryotique de façon à avoir un brin d'ADNc (adn complémentaire) que l'on peut introduire dans un vecteur en vue d'un clonage. Cet ADNc une fois traduit dans des cellules procaryotiques donne un ARNm sans introns qui peut être traduit sans trops de problèmes. Ces ADNc peuvent aussi servir de sondes radioactive (northern ou southern) pour détecter, voir doser un ARNm correspondant.

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Differences entre eucaryotes et procaryotes

	Eucaryotes	Procaryotes
Origine de réplication	multiple	unique
Protéine stabilisatrice de l'ADN simple brin	RP-A ou RF-A	SSB
Amorce ARN	oui synthétisée par alpha suivit par alpha ou béta ou epsilon dégradé par RNAse H trou bouché par alpha ou béta	oui synthétisée par une primase suivit par ADN pol III dégradé par l'ADN pol I trou bouché par l'ADN pol I
ADN polymérases	alpha: 1 polymérase 2 primases pas d'activité exonucléasique 3'->5' delta: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase epsilon: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase béta: répare les courts fragments d'ADN gamma: réplique l'ADN mitochondrial activité exonucléasique 3'->5'	ADN pol III: 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ADN pol I: activité exonucléasique 5'->3' 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ces 2 dernières activités forment le fragment de Klenow
Fragments d'Okazaki	200 nc	2000 nc
ADN ligase	I, II ou III	ADN ligase

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Vos questions, vos commentaires :

belkiss - Le 2010-03-14 22:40:31

role des primase

profbioch - Le 2010-03-15 00:10:59

La primase (numéro 5 sur l'animation Flash) synthétise les amorces ARN (en bleu) des fragments d'Okazaki. La primase est différente de l'ARN pol : elle est résistante à la rifampicine, synthétise des courts fragments (10 nucléotides) et n'est pas spécifique de la séquence d'initiation.

E.O - Le 2010-04-26 14:24:31

ATTENTION
La transcription inverse est la synthèse d'ADN à partir d'une matrice d'ARN !!!

profbioch - Le 2010-04-26 14:45:35

Bonjour, vous avez du lire un peu trop rapidement, c'est bien ce que je met:
"La transcription est la réaction de synthèse d'ARN avec comme matrice un brin d'ADN; cette réaction est catalysée par l'ARN polymérase ADN dépendante (ou transcriptase). La transcription inverse est la réaction inverse de la transcription. C'est la synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice ARN grâce à l'ADN polymérase ARN dépendante ou encore transcription inverse ou reverse transcriptase."

PharmaGirl - Le 2010-05-03 18:35:46

Bonjour, dans deux semaines, je passe la deuxième partie du Concours Pharma, et j'aurais quelques questions de dernières minutes en BioMol...
Je n'arrive pas à comprendre comment l' ADN Pol I intervient dans la réparation par excision de bases lors de la réplication. Je sais qu'il possède une fonction d'édition avec son activité exonucléasique qui lui permet la réparation des mésappariements. Mais pour les bases, sincèrement je ne vois pas...
Merci infiniment d'avance.
Wendy

profbioch - Le 2010-05-04 09:37:15

Bonjour PharmaGirl, en fait quand une base est mes-appariée, c'est que la base qui viens d'être ajoutée n'est pas la bonne, le complexe protéique doté d'une activité exonucléasique s'en rend compte, fais marche arrière et "détache" la base en cause, la bonne base arrive et la synthèse reprend. Ce n'est pas la base qui est modifiée chimiquement pour passer par exemple de A à T

PharmaGirl - Le 2010-05-05 14:31:06

Bonjour, merci je comprends mieux maintenant. Enfin, je pense m'être prise un peu trop la tête pour peu. Merci. Pouvez vous me donner très brièvement les fonctions rapportées aux sous unités alpha et epsilon de l'ADN Pol III...

PharmaGirl - Le 2010-05-06 15:48:39

Bonjour, ce n'est pas la fonction epsilon que j'ignore mais la tau. Et... Aidez moi, c'est fondamental ! La DNAse I impliquée dans le foot printing fait des coupures aleatoires ou specifiques ?? Merci d'avance...

L3bio - Le 2010-05-27 19:38:09

bonjour, il me semble que les tau permet de lier chaque monomère, en ce qui concerne le foot print, la DNAseI ne fait pas de coupure spécifique, on la laisse agir un temps donné pour pratiquer une hydrolyse ménagée, elle coupe un peu partout au pif sauf sur la séquence reconnue par la protéine qui apparait ensuite après électrophorèse et autoradiographie (merci de me reprendre si je me plante, mes partiels sont dans une semaine)

Brigitte lille - Le 2010-05-28 13:40:19

BONJOUR!
Je voulais savoir pourquoi les telomères ne sont pas repliqués
et puis qu'est ce qui engendre l'arret du complexe réplicatif lors de la réplication? la taille limite du fragment d'okazaki?
Une dernière chose, la structure de l'adn polymérase III possède 2 pinces beta ce qui signifie qu'il y a fixation de cette holoenzyme apres l'hélicase! mais je ne comprend pas bien l'action de l'enzyme sur le brin retardé! Elle est engendré par la partie a forte processivité du complexe? Je ne vois pas très bien comment ça se passe structurellement Merci d'éclairé ma lentairne

profbioch - Le 2010-05-29 11:27:54

@Pharmagirl: pour la protéine Tau, je dirais comme L3bio, elle a un rôle structurale, je ne lui connais pas de rôle fonctionnel. Pour la foot printing, on soumet le fragment d'ADN à une digestion endonucléasique ménagée qui provoque statistiquement une coupure par brin, il n'y a aucun intérêt à avoir des coupures spécifiques, au contraire. Donc L3bio à tout bon, les partiels s'annoncent biens.
Juste une chose, l'autoradiographie n'est qu'une méthode de révélation, il en existe d'autres comme par exemple le bromure d'éthidium :
http://fr.wikipedia.org/wiki/Bromure_d%27%C3%A9thidium

@Brigitte: la terminaison se produit quand 2 fourches de réplications se percutent, ou alors quand une fourche passe sur un signal de terminaison de la réplication. Par contre pour le "brin retardé" je ne vois pas trop de quoi il s'agit, c'est le brin synthétisé de manière discontinue ? avec la synthèse d'amorce ARN, qui est ensuite dégradé et remplacé par de l'ADN, les explications sont juste sous l'animation flash.

L3bio - Le 2010-05-29 14:57:37

les tellomères correspondent aux dernières amorces ARN qui sont dégradées(par la RNase H1 et FEN1, me semble-t-il) et non remplacées par de l'ADN, les polymérases ayant besoin d'une extrémité 3'OH, résultat les cellules eucaryotes perdent une dizaine de nucléotides à chaque réplication. Les tellomères sont des séquences en bout de chromosomes qui ne servent qu'à être perdues.
Ainsi, les cellules eucaryotes ont un nombre de divisions limitées sauf Les cellules germinales ainsi que la plupart des cellules cancéreuses qui ont une tellomérase dont le rôle est de synthétiser de nouveaux tellomères

biolman univ - Le 2010-06-29 15:57:45

bonjour je voudrais savoir le cycle d un retro virus

profbioch - Le 2010-06-29 16:16:19

Bonjour biolman univ, vous le savez certainement déjà, mais il y a 2 familles de virus, les virus à ADN et les virus à ARN, dans les 2 cas vous aurez de plus amples explications ici :
http://www.microbe-edu.org/etudiant/multivirale.html