La replication chez les eucaryotes, procaryotes, différences et transcription inverse (reverse transcriptase)
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INTRODUCTION
Les bases azotées
Nucléosides et nucléotides
Structure I des acides nucléiques
Structure II de l'ADN
Structure II de l'ARN
Propriétés physicochimiques hybridation
Acides nucléiques et information génétique
Transfert d'information
BIOSYNTHESE DE L'ADN
La réplication chez les eucaryotes
La réplication chez les procaryotes
La transcription inverse
Différence entre procaryotes et eucaryotes
BIOSYNTHESE DE L'ARN
Transcription chez les eucaryotes
Transcription chez les procaryotes
ARN replicase ou ARN synthétase
BIOSYNTHESE DES PROTEINES
Traduction chez les eucaryotes
Traduction chez les procaryotes
Différences
GRENIER
Formules des acides nucléiques
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Définitions
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Replication chez les eucaryotes
Par rapport aux procaryotes la réplication est plus rare, car l'initiation est très contrôlée, de plus, l'ADN est sous forme de chromatine. L'ADN s'enroule autour d'un octamère d'histones (200pb autour de (h2a h2 b h3 h4)2 ) formant ainsi un nucléosome.
Les ADN polymérasesIl en existe 5 : alpha béta gamma delta epsilon. Alpha delta et epsilon participent à la réplication du chromosome.
| ADN polymérase | Nombre de sous unités | Activités |
| Alpha | 4 | 1 polymérase 2 primases 1 pour le maintient de la structure alpha n'a pas d'activité exonucléasique 3'->5' |
| Delta | 2 | 1 activité exonucléasique 3'->5' pas d'activité primase, processivité faible |
| Epsilon | 2 | 1 activité exonucléasique 3'->5' Pas d'activité primase, forte processivité |
| Béta | 1> | impliquée dans la réparation de courts fragments d'ADN |
| Gamma | 1 | 1 activité exonucléasique 3'->5' responsable de la réplication de l'ADN mitochondriale dont la réplication est indépendante de l'ADN nucléaire |
Initiation
Compte tenu de la taille des brins d'ADN chromosomique la réplication a certainement plusieurs origines de réplication.
Chaques origines de réplication est appelée oeil de réplication.
Pour un oeil de réplication, on a 2 complexes multienzymatiques qui vont en sens inverse. Chez les eucaryotes les fragments d'Okazaki sont plus petit (environ 200pb). Ces fragments ont à leur extrémité 5' des fragments d'arn (10 nucléotides) syntéthisés par une primase:
- Soit alpha synthétise les amorces ARN et les allonge sur le brin à synthèse discontinue de l'ADN naissant. Pour le brin à synthèse continue le complexe ADN polymérase delta/pcna synthétise le brin d'ADN(pcna est une protéine qui augmente fortement la processivité).
- Soit alpha est uniquement responsable de la synthèse des amorces et quelques désoxynucléotides. Le brin continu est répliqué par epsilon; delta/pcna réplique le brin discontinu.
Dans tous les cas on a sur un brin une ADN polymérase très processive et sur l'autre brin la processivité est moindre.
Lors de la réplication l'adn simple brin est stabilisé grâce à des protéines : rp-a ou rf-a, équivalent aux ssb chez E.Coli (single stranded dna binding protein). Les amorces arn sont supprimées par la rnase h, les trous ainsi formés sont bouchés par béta ou alpha. Les fragments sont reliés une adn ligase. il existe 3 adn ligase (i, ii,iii) dont la i est indispensable à la réplication du chromosome. Quand aux topo-isomérases, il y en a 2 (i et ii).
Terminaison
D'après des études sur SV40 (réplication bidirectionnelle) la réplication s'arrête sous l'effet de contraintes topologiques.
Activite correctrice des ADN polymerases :
- Procaryotes : pour E.Coli (4.106pb) le taux d'erreurs acceptable serait de l'ordre de 10-6 à 10-7 mais la seule complémentarité des bases ne le permet pas. Ceci étant dû à la tautomérisation. Si on a ajout d'un nucléotide sous la forme énol, le retour à la forme céto provoque un mésappariement. L'ADN polymérase est alors bloquée et doit revenir en arrière grâce à son activité exonucléasique 3'->5' ( sous unité epsilon de l'adn polymérase iii).
- Eucaryotes : le génome est beaucoup plus important (homme 3.5 109pb) la fidélité doit être de 109. Ceci est peut être dû à une activité exonucléasique 3'->5' sur delta et alpha. Plus les polymérases sont processives, plus le taux d'erreurs est faible.
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Replication chez les procaryotes
L'enzyme réplicatif n'est pas l'ADN pol I mais III. L'ADN pol II serait impliquée dans la réparation de l'ADN.
Initiation
E.Coli n'a qu'une origine de réplication. L'initiation se passe en 3 étapes :
- Reconnaissance de la séquence d'origine par une seule protéine.
- Ouverture dans une région riche en A et T, proche ou dans l'origine de réplication.
- Assemblage du complexe de réplication dans la partie ouverte de l'ADN.
L'ouverture de l'ADN se fait grâce à la DNA a, ensuite la DNA b (hélicase) sépare les 2 brins sur une plus grande distance dans le sens 5'->3'. Pri A agit de la même façon de 3'->5'.
L'ouverture de l'ADN va provoquer des supertours qui vont être éliminés par l'ADN gyrase (topo-isomérase). Une fois que l'ADN est dans de bonnes conditions topologiques, l'amorce est synthétisée par la primase. Ce complexe protéinique est le complexe d'initiation ou primosome.
Progression de la fourche de replication
Chez E.Coli la principale enzyme est l'ADN polymérase III holoenzyme. C'est une enzyme réplicative sous la forme d'un dimère asymétrique constituée de 10 polypeptides (en fait 2*5).
- 3 pour le noyau (core) de l'enzyme:
- alpha : polymérase
- epsilon exonucléase 3'->5'
- psi : activité inconnue
- 2 béta se fixent au core de façon à lier fortement le core à l'amorce et au modèle.
La partie très processive s'occupe certainement de la synthèse continue pendant que la partie moins processive s'occupe de la synthèse discontinue.
L'ADN est déroulé par une ADN hélicase (1) ou DNA B, les supertours ainsi produits sont éliminés par une topo-isomérase (2) ou ADN gyrase. Les simples brins d'ADN formés sont stabilisés par des protéines SSB (3) (single stranded dna binding protein), elles permettent aussi d'éviter la dégradation de l'ADN par les dnases. La primase (5) synthétise les amorces ARN (en bleu) des fragments d'Okazaki. La primase est différente de l'ARN pol : elle est résistante à la rifampicine, synthétise des courts fragments (10 nucléotides) et n'est pas spécifique de la séquence d'initiation.
Ces amorces sont ensuites prolongées par l'ADN pol III holoenzyme. L'ADN pol I prend le relais jusqu'au fragment d'Okazaki suivant, elle dégrade l'amorce ARN du brin grâce à son activité exonucléasique 5'->3' non spécifique de l'ADN tout en remplaçant le brin d'ARN par de l'ADN. Une fois que l'amorce ARN a été entièrement remplacée par de l'ADN les 2 fragments sont reliés covalemment par l'ADN ligase qui forme une liaison phosphodiester entre un 3' oh et un 5' monophosphate. L'ADN ligase est inactive sur une extremité 5' monophosphate ARN.
Tout ces enzymes sont ensemble de manière à former un complexe dont la vitesse peut atteindre 500 à 1000 nucléotides par seconde. Ce complexe s'appelle le replisome et il peut se charger de la synthèse des 2 brins (précoce et tardif) à condition qu'il y ait une boucle formée par le brin d'adn tardif. La synthèse se fait sur les 2 brins simultanément car ils ont la même polarité.
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La transcription inverse
La transcription est la réaction de synthèse d'ARN avec comme matrice un brin d'ADN; cette réaction est catalysée par l'ARN polymérase ADN dépendante (ou transcriptase). La transcription inverse est la réaction inverse de la transcription. C'est la synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice ARN grâce à l'ADN polymérase ARN dépendante ou encore transcription inverse ou reverse transcriptase.
In vivo : comme pour la transcription, une amorce est nécessaire. L'ADN qui est synthétisé sert en même temps de matrice pour la synthèse d'un autre brin d'ADN :
L'ADN bicaténaire peut être intégré dans l'ADN de la cellulle hôte, on parle alors de provirus ou de prophage. Le traitement du SIDA se fait grâce à un inhibiteur de la reverse transcriptase : l'AZT (azidothymidine).
In vitro : on peut volontairement synthétiser un brin d'ADN à partir d'un ARN en particulier de l'ARNm eucaryotique de façon à avoir un brin d'ADNc (adn complémentaire) que l'on peut introduire dans un vecteur en vue d'un clonage. Cet ADNc une fois traduit dans des cellules procaryotiques donne un ARNm sans introns qui peut être traduit sans trops de problèmes. Ces ADNc peuvent aussi servir de sondes radioactive (northern ou southern) pour détecter, voir doser un ARNm correspondant.
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Differences entre eucaryotes et procaryotes
| Eucaryotes | Procaryotes | |
| Origine de réplication | multiple | unique |
| Protéine stabilisatrice de l'ADN simple brin | RP-A ou RF-A | SSB |
| Amorce ARN | oui synthétisée par alpha suivit par alpha ou béta ou epsilon dégradé par RNAse H trou bouché par alpha ou béta | oui synthétisée par une primase suivit par ADN pol III dégradé par l'ADN pol I trou bouché par l'ADN pol I |
| ADN polymérases | alpha: 1 polymérase 2 primases pas d'activité exonucléasique 3'->5' delta: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase epsilon: activité exonucléasique 3'->5' pas de primase béta: répare les courts fragments d'ADN gamma: réplique l'ADN mitochondrial activité exonucléasique 3'->5' | ADN pol III: 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ADN pol I: activité exonucléasique 5'->3' 1 polymérase activité exonucléasique 3'->5' ces 2 dernières activités forment le fragment de Klenow |
| Fragments d'Okazaki | 200 nc | 2000 nc |
| ADN ligase | I, II ou III | ADN ligase |
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